采集何首乌药材薄层色谱指纹图谱

采集何首乌药材薄层色谱指纹图谱

中药何首乌(Radix Polygoni Muhiflori)为蓼科植物何首乌(Polygonum multiflorum Thunb．)的干燥块根[1] ，主产于我国广东、四川、湖南、贵州、河南等省区[2]，具补肝肾、益精血、壮筋骨、乌须发之功效。现代研究表明何首乌主要含蒽醌类、二苯乙烯苷类和磷脂类等有效成分，其药物效应各有不同 [3]。作为我国一种名贵中药材，何首乌野生资源日益紧缺，人工栽培品受产地、气候和生态环境等因素影响尚缺乏从品种到质量的统一规范，不同产地何首乌质量评价已引起广泛重视 [4-5]。薄层色谱指纹图谱具有色谱的彩色图像特征性强，展开剂选择范围广，组成十分灵活等特点，应用于中药的质量控制，可以综合地、直观地反映药材的内在质量[6]。本研究采用薄层色谱分析，初步建立不同来源何首乌药材的指纹图谱，为何首乌药材的综合质量评价提供理论依据。

1 仪器与试药

1．1 仪器
       CAMAG TLC scanner 3(瑞士卡玛公司)；BS124S电子分析天平(德国Sartorius)；定量毛细管(Drummond USA)；DL-360A超声波清洗器(上海之信仪器有限公司)。
1．2 试药
       大黄素对照品(批号110756-200110，中国药品生物制品检定所)；大黄酸对照品(批号0757-200206，中国药品生物制品检定所)；大黄酚对照品(批号110796-200311，中国药品生物制品检定所)；大黄素甲醚对照品(批号110758-200307)，中国药品生物制品检定所)；2，3，5，4 -四羟基二苯乙烯-2， -D -D-葡萄糖苷对照品(批号1 10844-200404，中国药品生物制品检定所)；何首乌对照药材(批号120934-200507，中国药品生物制品检定所)；硅胶G(青岛海洋化工厂)；其余试剂均为分析纯。何首乌药材，由广东药学院中药学院药用植物与中药鉴定教研室提供并鉴定(见表1)

2 方法与结果

2．1 溶液制备
        2．1．1 对照品溶液的制备：取2，3，5，4 -四羟基二苯乙烯-2-D -D-葡萄糖苷对照品4 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加稀乙醇适量，超声3 min使溶解，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。分别取大黄素、大黄酚和大黄酸对照品各2 mg，大黄素甲醚对照品1 mg，精密称定，置2 ml量瓶中，加甲醇适量，超声5min使溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。分别精密量取上述大黄素、大黄酚、大黄酸和大黄素甲醚对照品溶液各20 l，混合，作为对照品溶液I；另精密量取上述大黄素对照品溶液和2，3，5，4 -四羟基二苯乙烯-2-D -D-葡萄糖苷对照品溶液各10ul，混合，作为对照品溶液Ⅱ。
        2．1．2 供试品溶液与对照药材溶液的制备：取本品粉末(过四号筛)和何首乌对照药材粉末各0．2g，精密称定，置锥形瓶中，加入甲醇50 ml，超声提取30 min，滤过，滤液蒸于，残渣用甲醇溶解，定容至2mL量瓶中，摇匀，用0．45um滤膜滤过，即得。
2．2 薄层色谱条件
       薄层板：硅胶G(0．4％CMC-Na)，105℃活化1 h；点样量：供试品溶液、对照品溶液I各5ul，对照品溶液Ⅱ10 uL；展开系统：石油醚-乙酸乙酯一甲酸(15：5：1)为展开剂I；三氯甲烷-甲醇-水[6．5：2．25：0．42，pH=4．0(以醋酸-醋酸钠缓冲液调节)]为展开剂Ⅱ；检测方式：紫外灯下(365nm)成像。扫描条件：入_s=300 nm，入_R=370 nm。
2．3 方法学考察
       2．3．1 精密度试验：取同一供试品溶液(何首乌对照药材溶液)，在同一薄层板上连续点样5次，测得两个展开系统中大黄素峰和2，3，5，4 -四羟基二苯乙烯-2-D-D-葡萄糖苷峰的峰面积，RSD分别为3．5％和2．7％，表明本法精密度良好。
       2．3．2 重复性试验：取同一供试品5份(何首乌对照药材)，按2．1．2项下方法制备供试品溶液，依法操作。测得两个展开系统中大黄素峰和2，3，5，4 -四羟基二苯乙烯-2-D -D-葡萄糖苷峰的峰面积，RSD分别为3．8％和4．9％ ，表明本法重复性良好。
       2．3．3 稳定性试验：取同一供试品溶液(何首乌对照药材溶液)，分别在0，6，12，24和48 h依法操作，测得两个展开系统中大黄素峰和2，3，5，4 -四羟基二苯乙烯-2-D -D-葡萄糖苷峰的峰面积，RSD分别为4．2％ 和3．3％ ，表明本品供试液较稳定。
2．4 实验条件的考察
        2．4．1 提取方法的考察：1号德庆样品分别用①甲醇，②乙醇，③三氯甲烷．甲醇(3：1)，④三氯甲烷，⑤乙醚超声提取、浓缩，⑥ 甲醇超声提取、蒸干、残渣加水溶解、醋酸．醋酸钠缓冲液(pH=4．0)调节使成酸性、加三氯甲烷提取、分取三氯甲烷层、浓缩、蒸于、残渣用甲醇溶解。依法操作，结果表明①和③提取方法在不同展开系统中斑点展开清晰，分离效果较好，为简化操作，选择① 甲醇作为提取溶剂。
        2．4．2 展开系统的考察：甲醇为提取溶剂，分别比较①石油醚．乙酸乙酯．甲酸(15：5：1)，②环己烷-乙酸乙酯-甲酸(15：5：1)，③ 三氯甲烷．甲醇．水(7．5：2．5：0．2)，④三氯甲烷．甲醇一水[6．5：2．25：0．42，pH= 4．0(以醋酸一醋酸钠缓冲液调节)]，⑤ 三氯甲烷-甲醇．水[6．5：2．25：0．42，pH：4．0(以醋酸-醋酸钠缓冲液调节)，4℃展开]，⑥苯一乙醇(2：1)／苯-乙醇(4：1)(中国药典2005年版⋯)展开系统的薄层色谱指纹图谱。结果表明何首乌中蒽醌类成分常用展开剂①石油醚．乙酸乙酯．甲酸，斑点展开清晰，分离效果好，作为展开系统I；与中国药典2005年版收载何首乌药材鉴别方法⋯相比，在常温下何首乌经④三氯甲烷一甲醇一水[6．5：2．25：．0．42，pH=4．0(以醋酸-醋酸钠缓冲液调节)]展开后，斑点展开较清晰，而且荧光条带更多，信息量更为丰富，作为展开系统Ⅱ。
2．5 薄层色谱指纹图谱的建立
       依照上述实验条件获得的薄层色谱三维扫描图谱。展开系统I获得的指纹图谱中不同产地何首乌药材具有一定的相似性，除去原点与前沿，共检出4个共有峰。在展开系统Ⅱ所获薄层色谱三维扫描图，跗值在0．1～0．8之间的10个共有峰构成了何首乌薄层色谱指纹图谱基本骨架。由于多数峰没有达到基线分离，且色谱峰宽窄不一，因此采用峰高值来表示各组分之间的相对含量。不同采集地何首乌药材共有峰峰高柱状图，如图1所示，不同产地各峰的高低不一。其中不同产地药材均具有2，3，5，4 ．四羟基二苯乙烯-2-D -D-葡萄糖苷峰，而且含量变异较少(仅l0号田阳样品除外)，可作为何首乌鉴定的特征性成分，但是作为不同产地的药材质量评价没有特征性意义。其它色谱峰构成的指纹特征，不同采集地的药材质量可以从其峰高得到反映，尤其是大黄素和大黄素甲醚所代表的特征峰。其中，通过峰高柱状图可以判定10田阳样品质量与其它产地样品差异较大，这与其含量测定的结果是一致的[5]。

3 讨论

       3．1 葸醌类、二苯乙烯苷类和磷脂类成分为何首乌的主要有效成分，该部位成分群体的一致性(包括成分种类及其相对含量的一致性)能够保证药效的稳定。薄层色谱指纹图谱建立过程中，磷脂类成分以磷脂酸(L-α-phosphatidylethanolamine，PA)和磷脂酰胆碱(L-α-phosphatidylcholine，Pc)为对照品，三氯甲烷-甲醇-水为展开剂，结果在与对照品相同Rf位置处并未观察到相同颜色的荧光斑点。Nash 等人认为，三氯甲烷一甲醇．水三相不同浓度配比对分离磷脂类成分有显著的影响，水在展开剂中的含量对分离起很大作用。本研究中，增加上述展开剂中水的用量，体积比从2％增加到0．46％ ，并用pH=4．0的缓冲液代替水，结果表明PA和Pc对照品溶液分离效果好，但未观察到样品中磷脂类成分的荧光斑点，可能与方法的灵敏度低和磷脂类成分不稳定等因素有关。因此本研究仅以蒽醌和二苯乙烯苷类成分综合评价何首乌药材的内在质量。
       3．2 薄层色谱分析由于其快速、分析成本低、在同一薄层板上可同时平行分析多个样品、可提供彩色图像、形象直观等优点，应用于中药色谱指纹图谱分析时，通过稳定性、精密度及重复性考察，显示本法适用于何首乌药材内在质量评价。

参考文献

[1]国家药典委员会．中华人民共和国药典．一部．北京：化学工业出版社，2005：123．
[2]中国科学院中国植物志编辑委员会．中国植物志．北京：科学出版社，1998，25(1)：102-103．
[3]苏纬，郭群．何首乌的现代药理研究概况．中草药，1997，28(2)：119．
[4]武政，张勉，张朝风，等．36批何首乌药材质量的HPLC指纹图谱评价研究．中国药学杂志，2006，41(4)：257．260．
[5]傅军，严寒静，梁从庆，等．不同采集地何首乌的质量评价．广东药学院学报，2006，22(3)：253．254．
[6]谢培山，林巧玲．白芍总苷的薄层色谱指纹图谱实验研究．中药新药与临床药理，2004，15(3)：171．173．
[7]Nash A，Kraus Lj．Behavior of vegetable phospholipids in TLC optimization of mobile phase，detection and direct e．valuation．J．Chromatogr，1990，502：385．392．