兴奋剂促红细胞生成素免疫检测方法的研究

　　本研究成功地制备了两株抗重组EPO(rHuEPO)的单克隆抗体，建立了检测血清中EPO含量的竞争酶联免疫吸附方法；同时，把从钝顶螺旋藻中提取纯化的藻胆蛋白作为荧光标记物，标记单克隆抗体，建立了检测血清中EPO含量的荧光免疫法。经与酶联免疫吸附方法(ELISA)比较，无显著差异。本研究首次用荧光探针藻胆蛋白(PBP)标记检测EPO，建立了可用于体育药检的特异的检测方法。这对兴奋剂EPO的检测具有重要的意义。

1.1　材料

　　rHuEPO(中日友好医院惠赠)，抗rHuEPO杂交瘤细胞株、钝顶螺旋藻由北京大学生命中心单克隆抗体实验室提供，BALB/c小鼠、昆明小鼠购自流行病研究所。DEAE-SepharoseFastFlow、Phenyl-sepharoseCL-4B, ProteinASuperoseFastFlow、sephacrylS-200HR、SephacrylS-300HR均为Pharmacia产品。其余试剂为Sigma产品或国产分析纯试剂。
1.2　方法

1.2.1　抗人促红细胞生成素单克隆抗体的制备
　　复苏抗rHuFPO杂交瘤细胞，采用动物体内诱生单克隆抗体的方法，大量制备腹水。用快速蛋白液相分析仪(FPLC)，联合使用疏水柱(Phenyl-SepharoseCL-4B)和ProteinASuperoseFastFlow柱纯化单克隆抗体。

1.2.2　单克隆抗体理化性质及亲和力的鉴定
　　采用双向免疫扩散法、紫外分光光度计法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分别测定单克隆抗体的免疫球蛋白类别及亚类、浓度和分子量。参照Beatty等人所建立的方法，寻求抗体与固定化抗原亲和常数。确定抗体的工作浓度，并以此浓度，按照Friguet的方法选择最合适的抗原包被量。作OD450nm与对数抗原稀释度的关系曲线，求得液相亲和常数。

1.2.3　藻胆蛋白的制备、纯化及性质测定
　　培养钝顶螺旋藻，收集的鲜藻泥通过硫酸铵分级分离法得到藻胆蛋白的粗品。联合使用DEAE-SepharoseFastFlow离子交换柱和SephacrylS-200HR柱进一步纯化藻胆蛋白，得到的纯品进行分子量测定，并测定藻胆蛋白的激发和发射光谱。

1.2.4　单克隆抗体?藻胆蛋白荧光探针的制备
　　5mgPBP和5μgSPDP依洪孝庄等人的方法进行偶联，制备单抗-藻胆蛋白的偶联物。

1.2.5　竞争酶联免疫吸附试验检测方法
　　检测血清EPO的含量以测定抗体与溶液中抗原的亲和常数时所用抗体浓度作为抗体的工作浓度，并以其所用抗原包被量包被酶标板。将含一定量rHuEPO的标准溶液按倍比稀释与定量McAb溶液分别混合，室温下温育15min后加入以rHuEPO包被的酶标板中，以EPO稀释倍数的对数(以2为底)为横坐标，OD450nm为纵坐标绘制标准曲线。将正常人血清100μ1与建立标准曲线时同样量McAb混合，室温下温育15min后加入与建立标准曲线时同样量rHuEPO包被的酶标板中，同上操作，所测数据即为血清中EPO含量的OD值，按照标准曲线可以得到血清中的EPO含量。

1.2.6荧光免疫法检测血清中EPO的含量
　　用McAb包被酶标板，4℃冰箱过夜后0.01MPBS-PBP探针的混合物(此混合物已在4℃过夜)37℃下保温1h，酶标板用PBS-T洗涤(3×3min)，加入荧光洗脱液100μ1/孔，50℃下温育30min。同一样品做5孔。收集相同5孔内的液体，HITACHIF-4500荧光分光光度计测荧光最大发射峰值对应的荧光强度，画出标准曲线。用McAb包被，4℃冰箱过夜后0.01MPBS-T洗3次，每孔加入50μl正常人血清样品与过量IgG-PBP探针的混合物(此混合物已在4℃过夜)，以下操作同上，荧光分光光度计测荧光最大发射峰值对应的荧光强度后，按照标准曲线可以得到血清中的EPO含量。

2.1　单克隆抗体的性质
　　我们得到了稳定分泌抗rHuEPO单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别为McAbF8,McAbF11。经琼脂双向免疫扩散法鉴定，McAbF8的亚类为IgG1，McAbF11的亚类为IgG2b。

　　分子量均为147kD。McAbF8与固定化rHuEPO的亲和常数为2.3×106M^-1。

　　按照1.2.2所述方法，测得在抗原包被量为每孔0.02μg时，OD450nm与一抗浓度成正比，且酶标板上抗原对抗体的吸附量小于10％。

　　测得APC两个亚基具有相同的分子量，均为23.5kD。APC分子量为47kD。APC的激发和发射光谱采用HITACHI－F4500荧光分光光度计进行测定，确定最佳激发波长为575nm，最佳发射波长为662nm。

2.3　单克隆抗体-藻胆蛋白荧光探针的制备
　　依1.2.4所述方法制得McAb-APC偶联物。其中洗脱缓冲液为0.1mol/L的PBS(pH7.5)，流速0.25ml/min。峰a为Ig-APC偶合物，峰b为未标记的McAb和APC。

2.4竞争ELISA法检测血清EPO含量标准曲线的制定
　　测得在抗原包被量为每孔EPO0.2μg，McAbF8含量为1.0×10^-10M时，OD450nm与一抗浓度成正比。由于所选用的抗体工作浓度在图1所示的线性范围内，所以当加入竞争抗原后相对于不加竞争抗原的对照孔所降低的OD值(△OD)与竞争抗原所结合掉的抗体量成正比，所以可以用降低的OD值(△OD)与对照孔吸收值OD0之比代表被结合的抗体量与总抗体量之比。

　　OD和OD0分别表示加有竞争抗原和不加竞争抗原时的吸收值，OD代表加入竞争抗原后光吸收值的变化，[Ab]为与竞争抗原结合的抗体浓度，[Ab]0是抗体的总浓度。其中[Ag]0=7.4×10^-10M2.5荧光免疫法检测血清EPO含量标准曲线的制定按1.2.6的方法，以相对荧光强度对EPO稀释倍数的对数作图，即得标准曲线。

2.6　竞争ELISA法与荧光免疫法测定血清EPO含量对比
　　分别对20例正常人血清用以上两种方法进行测定。

　　兴奋剂检测作为反兴奋剂的手段已成为各大赛事中必不可少的一项内容。EPO是国际奥委会禁用的肽类激素的一种，国际上还没有制定出EPO的检测方法，但精确检测EPO浓度是确定其检测标准的首要条件。以单克隆抗体(McAb)为基础的免疫化学检测方法由于具有灵敏度高，特异性强，方便、快速等特点，成为EPO最具潜力的检测方法。

　　近年来，藻荧光蛋白作为一种新型探针逐渐受到人们的重视，为检测提供新的有效途径。藻胆蛋白在钝顶螺旋藻中的含量非常丰富，可以占到总蛋白含量的70％以上，这为它的大量纯化创造了便利条件。PBP的水溶性好，多次冻融仍能保持其蛋白活性。PBP的表面又具有多种表面功能基因，易于偶联到多种小分子和大分子蛋白质上，为其作为探针的应用奠定了基础。作为一种荧光探针，藻胆蛋白具有其它物质难以比拟的优点，以APC为例，其STOKES迁移达到87mm，激发波长位于可见光区，摩尔吸光系数为10⁶数量级，荧光产率高，且联结于抗体或抗原时不损害它们的活性，完全符合检测血清样品的要求，尤其广泛应用的是单克隆抗体和PBP形成的荧光探针，它利用单抗纯度高，特异性强的优点来检测样本，大大提高了检测的敏感性和准确性，日益受到人们的重视。

　　蛋白质偶联技术现在已获得了广泛的应用，它是建立在双功能试剂应用的基础上。SPDP是一种效果很好的双功能试剂。

　　表1竞争ELISA与免疫荧光检测结果的统计学比较

　　注：t=0.02292,P=0.98183,“E”为竞争ELISA的结果，IF为免疫荧光检验结果，在0.05水平上，二者差异无意义。
　　它能在蛋白质ε-NH2端添加硫醇基；在DTT存在的情况下，又使硫醇基生成巯基。一种蛋白质的硫醇基和另一种蛋白质的巯基结合，从而使两种蛋白偶联。本研究就是通过此原理将IgG与APC偶联的。从本实验的偶联图谱中可以看到：由于偶联到IgG上的APC分子数目不能保持完全一致，因此在应用偶联物时取图谱对应峰值两侧很近的一段区间内的IgG-APC作为应用物，这样就保证了偶联物分子量的均一。这种偶联物可以认为是均一的荧光探针，保证了在后面实验中所用偶联物的稳定性和一致性。
　　ELISA作为一种比较成熟的方法，已在医学临床检测中获得了广泛的应用，成为替代放射性免法的首选方法。本实验建立的竞争ELISA法测得正常人血清中EPO含量与文献报道相一致，都在10^-11M的数量级。荧光免疫检测技术由于其自身的特点而成为取代放射免疫检测的另一种方法。它具有专一性强，灵敏度高，实用性好等优点，已用来检测含量很低的生物活性物质。本实验选用藻胆蛋白与单克隆抗体偶联，利用单克隆抗体的特异性和藻胆蛋白作为荧光探针的优越性，建立了可用于血清中EPO浓度检测的荧光免疫检测标准曲线，线性范围为10^-10～10^-12M。检测时以一种单抗包被，加入血清后，再加入另一种单抗与藻胆蛋的偶联物，这样可以利用双抗体夹心的原理捕捉到血清中极微量的EPO。经与竞争ELISA比较，二者测得血清中的EPO含量无显著差异，因此可以证明它在EPO的检测方法上有良好的应用前景，但尚有待更深入的研究，取得更多的数据，才能真正应用到实际工作中。